・学术新闻・ [作者] 万芳，博士南京大学医学院临床医学院（李恒）南京军区南京总医院肾内科在读生（南京，！”###！）通讯作者（刘志宏）万方应用数据氨基酸尿液检测方法在肾脏病中的应用 李恒 刘志红 崔敏 李雷士 摘要 目的：建立一种方便、快速、临床适用的氨基酸尿液检测方法，初步了解其在肾脏疾病中的应用价值 方法：！使用！ ,$%二硝基氟苯(“%&'()*%!,$%+,-,.*)/0-1)’,23&4）比色法(其中，根据不同蛋白去除方法，分为加热过滤法和三氯乙酸沉淀法）检测尿液中氨基酸氮含量，与反相高效液相色谱法（56%7689）比较，可靠根据正常志愿者的数据，正常 ra分别测定23&4%加热过滤法和23&4%三氯乙酸沉淀法检测尿氨基酸氮含量。 #在样品中加入不同浓度的防腐剂（甲苯），了解防腐剂的使用情况。检查23&4比色法对23&4检测结果的影响。将反应后的待测样品置于室温下！ $:，了解存储时间对测试结果的影响。 $统计患者临床资料，了解尿氨基酸氮含量与尿量、尿3；<酶、尿糖等指标的关系，了解引起氨基酸尿的常见疾病，初步了解氨基酸尿检测的临床价值。

结果：!23&4%加热过滤法与56%7689法检测尿氨基酸氮的相关系数为=>?=@。 23&4%三氯乙酸沉淀法与56%7689法的相关系数为=A?=@。 23&4%加热过滤法与23&4%三氯乙酸沉淀法的相关系数为==?#@，说明过滤法或沉淀法对尿氨基酸氮的检测可以得到比较准确的结果。 “根据$#例正常志愿者的测试结果，23&4%加热过滤法的正常范围是A$?B C!=>?$DE-,.*)E0-F!$:,23&4%三氯乙酸沉淀法 G>?G C HG>?#正常范围G>?G C HG>?# DE -,.*)E0-F!$:.#常用防腐剂甲苯浓度低于“#@”对尿氨基酸结果无显着影响23&4法检测氮。 反应完成后放入!$:内，检测结果无明显变化。患者的尿量与!$：氨基酸氮排泄之间没有显着相关性。患者常出现氨基酸尿和糖尿，但氨基酸尿多见于中草药中毒、遗传性肾炎等肾脏病。结论：!,$%二硝基氟苯比色法是一种方便快捷的尿氨基酸氮检测方法，可能有助于了解肾小管损伤程度，诊断中草药中毒、遗传性肾病等肾脏疾病。肾炎。

关键词氨基酸尿！，$%二硝基氟苯比色反相高效液相色谱！ “#$%&’&$&'() $**$+ ,-..$/’ 0 0)&).1’%$&’-% -, &-&$2 $1’% – $3’0* ‘% #.’%)!” #$%&, !”‘ () *)+%&, ,'” -*%, !” !$*.)*/$.$012) “%.3*343$ +56$ 7)1+703)8, 9*%:*%& #+.7*30:, 60%;*%& ‘%*<$1.*38 =*2*%$, 60%;*%&, !”###!!4567!869:;)3&'(): ;’.:)(E : I :,E:0* (* ,-I*J ID,-) IK,+ 0LK*0.,)- (ID,-)IK,+(*,I) :IM /00- N*)O0+ .) /0 I : I”DI*P)Q *0-I’ .(/(‘I* ,-R(*,0M, .).I’ (*,-I*J ID,-) IK,+M I*0 M.,” -).IOI,’I/’0 ,- *)(.,-0 K’,-,KI’ N*IK.,K0 ,- 9 :,-IS T) 0M.I/ ‘,M: I- 0IMJI-+ *IN,+ IMMIJ Q)* U(I-.,.I.,O0 +0.0*D,-I .,)- )Q (*,- I*J ID,-) IK,+M, “%&'()*%!, $%+,-,.*)/0-1)’ (23&4） MN0K.* )N:).)D0.*J ,-O0M.,EI.0+ V,.: *0MN0K。 .) ,.M M0-M,.,O,.J I-+ *0 ‘,I/,’,.J, I-+ .:0 ,-Q'(0-K,-E QIK.) *M V0*0 I-I’J10+S+: !$ :)(*M(*,-0 MIDN’0M V0*0 K)”0K.0+ ,- $# :0I’.:J I+(‘.O)'(-. 00*M I-+ !$# NI.,0-.M V,.: +,*0-. *0-I’ +,M)*+0*MS T) *0D)O0 (*,-I *J N*)%.0,-M (+0N*).0,-,1I.,)-), /), ‘,-E%,-Q,’.*I.,)- IMMIJ )* .*,K:’)*)IK0.,K IK,+%K0- .*,Q(EI. ,)- IMMIJ VIM INN’,0+ /0Q)*0 .:0 +0.0*D,-I.,)- )Q(*,-I*J ID,-) IK,+ MS W*,-I*J MIDN’0M V0*0 ,-K(/I.0+ V,.: 23&4 I. GAX Q)* !# D,- I-+ D 0.0* 0+ I. $!#-D /J I MN0K.*)N:).)D0.0*S50O0*M0+ N:IM0 :,E: N0*Q)* DI-K0 ‘,U( ,+ K:*)DI.)E*IN:J (56%7689） VIM N0*Q)*D0+ ,- “# MIDN’0M .) .:0 IKK (*IKJ )Q 23&4D< @0.:)+S T:0 K)0QQ,K,0-. )Q OI*,I-K0( 9S YS) )Q .:0 23&4 D0. :)+ VIM +<@ 0.0*D,-0+ /J .:0 OI'(0M )Q M.I-+I*+ M)'(.,)- )Q Q,*M.H# /I.K:0MS T:0 -)*DI' *I-E0 )Q 23&4 IMMIJ VIM +0.0*D,-0+ /J .:0 +I.I )Q O)'(-.00* MS Z-Q'(0 -K0 QIK.)*M M(K: IM .:0 I++,.,)- )Q N*0M0*%OI.,O0 (.)'(0-0）, Q)* +0N*) .0,-,1I.,)-, .,D0 )Q MIDN'0 M.)*IE0 V0*0 I-I'J10+S7)*#2&* : ; M,E-,Q,KI-。 K)**0'I.,)-M:,N VIMQ)(-+ /0.V00- .:0 *0M('.M ) Q 23&4 I-+ )Q 56%7689 IMMIJ ( 1 [ =A@, ? #?##") S T:0 .V) +,*0-. +0N*).0,-,1I., )- :I+・$A!・] 30N: *)' 2,I'J T*I-MN'I-.Y)'S""3)SH](-S!##!! " #$%!$&$'(!) $!&*+,!', "!)-, .,#+*) "& /012 (##(3 (! 4 556, " 7 8988: ); ; “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正常情况下，原尿中556以上的氨基酸被肾小管上皮细胞上的特定氨基酸转运蛋白重吸收[:]。

因此，正常人尿液中的氨基酸含量较少，并保持在相对恒定的水平。在一定的病理条件下，尿中氨基酸的排泄增多，导致氨基酸尿((B$!”(‘$D+.$()。氨基酸尿可出现在多种肾脏疾病中，如遗传性肾炎［J ]、中草药中毒性肾病[L,@]、1(!'”!$综合征、多发性骨髓瘤[G]和轻链沉积病[K]等。检测尿氨基酸含量有助于诊断具有一定的临床应用价值，但国内医院因条件不同，普遍未开展氨基酸尿的临床检测。本研究参考文献[A]，根据氨基酸氮能和J，@ F二硝基氟苯(:F1*+”.FJ,@FD$!$).”E,!U”*,/012）生成有色化合物的原理（图：），建立了一个简单、快速, 适合临床检查的尿液氨基酸定量检测方法，并对其临床可行性进行了探讨，从而奠定了基础用于氨基酸尿检测的临床应用和推广。 /(01213*4$5(“#”6 78/9,(5:4;(#”4$(.’2材料与方法2;2试剂与材料J,@F二硝基氟苯购自WXY=Z公司。: ,@F二恶烷(D$”S(!,)由上海永华特种试剂厂生产。

三氯乙酸购自上海化学试剂购供站。万方铵数据库酸标准品购自上海化学试剂公司。苯甲酸钠购自武汉有机合成化工厂。四硼酸钠购自南京化学试剂厂。定性滤纸（!:J9G’B）购自杭州新华纸业有限公司 2；<方法2；<；2备用试剂的制备！氨基酸标准溶液(G98 B%!$)."%,!M[)：含甘氨酸：AH9G"B"*M[，谷氨酸：AH9G"B"*M[，苯甲酸钠L@A98"B" *M[，盐酸：A9G BB"*M[，储存在@冰箱中。 #四硼酸钠溶液：含四硼酸钠：LJBB"*M[.$/012溶液：/012原液89KG B*溶于G8B*丙酮中，保存在@冰箱中，使用前用四硼酸钠溶液：]：8倍稀释. % 酸度：，@F 二恶烷溶液：：，@F 二恶烷溶液 G88 B* 添加：8 B* LA6 浓盐酸。& G6 三氯乙酸溶液。'酚酞指示剂：：88 B% 酚酞溶解于：88 B*无水乙醇。（89J B"*M[在氢氧化钠溶液中。2;<;</012 方法样品制备收集患者J@-尿液并测量体积。

可采用两种方法去除尿液中的蛋白质：取：B* 加：88 B* 于小烧杯中，加入 J8 B* 双蒸水，加入 JI L 滴酚酞指示剂，再加入适量89J B” *M[氢氧化钠溶液使溶液呈粉红色。然后加入L I@玻璃颗粒沸石煮沸G B$！。将定性滤纸折叠成锥形氨基酸尿，放在量筒上，过滤煮沸的样品倒入量筒，取少量双蒸水冲洗烧杯，过滤后装入量筒，使量筒内溶液量达到J8 B*。混合样品溶液，取： B*作为样品。#取89G B*尿液：9G B*,CC,!D”.&试管，加入G6三氯乙酸溶液：88″*，混匀后，G 888.MB$！离心G B$！，取上清K8″*，加5@8″*双蒸水，制成总体积：B*，作为样品。2;<;=/012方法显色步骤，建立标准曲线及结果计算/012法尿氨基酸氮检测显色步骤见下表：用含有：9JG,J9G,G,:8、J8B%!$)."%,!M[的氨基酸标准建立标准曲线。检测结果计算公式如下：J@-总尿氨基酸氮^ ' J8 'G' Urine M: 888・GGJ・ of and :: L Issue J88J Year K month！“#”标准溶液$ Urine #% & ('() 式中，“)&”为尿样稀释比例，“*”为标准品氨基酸氮浓度，“%&&&”为单位换算系数，“尿量”为患者）+，尿总量。

!”#$% &'()%*+ ,- ./01 2%)3,4-./01 .(‘.)64/07/57 .(‘.)6/’8.9(‘.):;&——64/07/57/’;03 /2;7 &—@/497 &:BC- &% >&% >&D02?E/497 ;0 F*G = /495 H35 )& ‘;0″2;7?./4;0( 7;3I/09*>&*>&*>&-./01 <,343'9495 EJ E./01 ./ 07 59/7 /E5>6 反相高效液相色谱(K@AL@MN)法检测尿液中氨基酸总量。肾病患者、正常人P例，分别采用K@AL@MN、:BC-A加热过滤法、:BC-A三氯乙酸法检测尿氨基酸。

K@AL@MN 使用 L@%&*& 氨基酸分析仪与邻苯二甲醛进行柱前衍生。向样品中加入等体积的乙腈去除蛋白质，然后根据氨基酸浓度稀释）Q R倍，上样，进行%R蛋白质氨基酸（聚糖、氰化物、缬草、亮、异亮、 Silk, su, cyst, egg, ), Gu, Lai, Jing, , , color, group, ) and) 主要非蛋白质氨基酸（牛磺酸和!A氨基丁酸）的检测。然后与 :BC 方法的结果进行比较。 &>5>7 防腐剂对：BC-法检测尿氨基酸氮的影响取尿样*&&”.，加入防腐剂甲苯&、PSO*、OS*、%*、P&、F&”。加入双蒸水%&&, TFS)*, T)S*, R*, O&, +&”., 使体系中甲苯含量分别为&SF)*U, %S)*U, )S *U，*U，%&U氨基酸尿，静置)+，之后分别采用BC-A加热过滤法和BC-A三氯乙酸法检测尿氨基酸氮，不同浓度甲苯对尿氨基酸氮的影响&>5 >8 放置时间对BC-法检测尿氨基酸氮的影响反应后的样品测试结果如下：尿液样品按前述BC-法操作，加酸），与+A二恶烷混合后立即进行比色检测。观察尿样的变化两个测试结果。

&>5>9 尿量对氨基酸尿检测的影响从尿氨基酸氮的计算公式可以看出。总尿氨基酸氮含量是尿氨基酸氮浓度和 )+ 尿量的乘积。为了了解氨基酸氮的排泄是否会随着尿量的增加或减少而增加或减少，我们收集了正常人的P&病例和最早使用的患者的O&病例：BC-氨基酸尿法检测（可能中草药中毒的患者除外）。采用相关性分析了解尿量对患者氨基酸氮含量的影响以及尿量与尿氨基酸氮浓度的关系。此外，我们还观察了同一患者在不同时间的氨基酸排泄情况，以了解尿量的变化是否会影响氨基酸氮的排泄。 &>5>：尿氨基酸氮含量正常范围的测定收集+&)+、健康志愿者的尿样，按上述方法检测，用统计学方法确定正常范围。 &>5>;氨基酸尿患者临床特征的初步分析通过对部分氨基酸尿患者的分析，氨基酸尿患者的疾病构成、尿氨基酸氮含量、尿B”V酶、尿视网膜结合蛋白(K-@)、尿溶菌酶等肾小管损伤指标。&>5>&<采用统计方法，根据每次测试的标准物的光吸收值确定该方法的变异系数。

将K@AL@MN测得的结果转化为氨基酸氮含量，再与BC-A加热过滤法和BC-A三氯乙酸法测得的数据进行线性相关分析。 ！查看。正常范围由 ! 的两侧 T*U 置信区间确定。分配。尿量与尿氨基酸氮浓度和)+、尿氨基酸氮排泄量的关系采用线性相关分析，相关显着性用!检验。 0=>’5′()”?4″@4 AB@C% ,- ./01 2%)3,45结果5>&：BC法检测的尿氨基酸氮标准曲线)·F*)・W B98,53. :;/.J X5/0%%B3>PW?0>)&&) 表示在！ “#$ % 该方法在#&'( )*+,-(.)/0 范围内具有良好的线性。上述范围对应#$ % 1&& ‘( /0，几乎可以覆盖所有患者！2！3456法检测尿氨基酸氮的批次间差异是因为3456法每批次所用的氨基酸标准品是同批次配制的冷藏(17）,所以检测值作为批间差异计算前8&批标准品1#&)’吸光度值&”!99&:&”&&;!,变异系数(< -.==*? ,*?)<., @2A2） 是 1"&BC。

这表明 3456 检测结果稳定且批次间差异很小。 2″@法、3456F加热过滤法和3456F三氯乙酸法的相关性在9$C以上，说明无论是使用3456F加热过滤法还是3456F三氯乙酸法都更准确地反映了尿氨基酸氮（表#，图8）.#$%&’!()’&$*+,-./+0.%’*1”-,+&67-8 +&*9$*’ ( ), 23456*9+:/&,9,$:’*+:$:+; ( 234566 ?>@=A ‘*/,;.!” >…