微小残留病（MRD）检测的突变位点通常为十几个到几十个，panel的覆盖范围小（<50Kb）。使用捕获技术准确检测大量低频突变需要极高的深度和准确性，这严重限制了检测的广度（即不同基因座的数量）。通常 DNA 测序的广度和深度之间固有的权衡意味着要么在高深度检测到少量突变，要么在低深度检测到许多突变，但不能同时检测到两者。
近日，在一份发表在国际期刊上的题为“of low-at low depth”的研究报告中，来自麻省理工学院、布罗德研究所、达纳-法伯癌症研究所和哈佛医学院的联合研究团队报告说一种称为“（次要）”的方法。突变特异的短链探针可以有效减少野生型reads的含量，大大减少测序数据量，同时利用 增加目标区域reads的比例。研究表明，可以以最小的测序规模和更低的成本从血液样本中准确高效地识别出数千种DNA突变。
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文章作者A表示：“在临床样本中发现罕见突变对于生物医学和诊断等领域具有重要意义。目前的技术需要大量测序才能发现低频DNA突变，灵敏度足以降低测序量减少了 99%。“准确检测血液样本中的肿瘤 DNA 对科学家来说是一个挑战，尤其是在寻找治疗后残留的少量 MRD 时。我们发现 MRD 检测需要更高的灵敏度。”
研究人员从两个人类细胞系中创建了 1:1000 稀释的剪切基因组 DNA，确定了独特的单核苷酸多态性 (SNP) 作为克隆突变的替代物，并生成了双重测序文库，文库被解析用于杂交捕获。随后，研究人员设计了大约 10,000 个具有严格长度和 ΔG 的探针dna突变，用于预定义突变的单核苷酸识别。只有含有跟踪突变的分子才能被捕获并测序，以达到错误抑制的双重目的。(图 1a) 该方法利用等位基因特异性杂交和短探针，以及异源双链和同源双链 DNA 之间的热力学差异 (图 1c)，来丰富条形码库，并通过测序检测双链上的突变。（图。
图 1. 以最少的临床样本测序实现准确的突变追踪。
研究人员对 16 名乳腺癌患者的组织活检进行了全外显子组测序，并确定了患者中 40 个突变的中位数。同时，研究团队将突变检测效果与常规检测组进行对比发现，常规检测组与常规检测组的验证突变得分相近，得分略低，这可能是由于探针丢失（图 2a）。与在 >0.10 VAF 时发现的较高比例的突变相反（图 2a），发现为“未验证”的突变往往来自肿瘤全外显子组测序的最低 VAF 部分。（图 2b）以上结果证明了能够准确验证在全外显子组和全基因组测序中发现的大量突变。
图 2. 全外显子肿瘤样本的指纹验证。
此外，研究人员还分析了是否可以通过追踪更多的 SNP 和有限的血容量来实现更高的灵敏度。1 μl 指尖血含有约 10 4 个白细胞。研究人员首先比较了传统检测方法在18×重复1:10 5 稀释液和17×重复阴性对照样品中检测438个SNP的效果。数据显示，在所有 1:105 稀释样品和阴性对照样品中分别发现了 81% 和 80% 的样品衍生 SNP，显着多于阴性对照（图 3a）。16×重复1:10 5 稀释液、17×1:10 6 稀释液和12×阴性对照分别检测10 4 个样品来源的SNPs，发现1:10 5 稀释样品中检测到的SNPs数量显着增加，显着高于阴性对照组。在 1:10 6 稀释液中也观察到更高的突变数。（图 3b）结果表明，跟踪数千个全基因组特定 SNP 可以显着提高信噪比，这对于检测极低水平的嵌合体很重要。
图 3. 可以在 1:105 稀释时检测到高于噪声的信号。
能否提高MRD检测效率？研究人员使用先前从癌症患者身上鉴定出的 cfDNA，并将其掺入健康个体样本的 cfDNA 中，以创建针对 1:100 至 1:305 肿瘤样本的稀释液。（图 4a）每个稀释度复制 20 ng 文库，使用常规方法在患者肿瘤全基因组测序中检测到 978 个全基因组单核苷酸变异 (SNV)。数据显示，978 个突变中的 94.7% 得到了验证。（图 4a）与传统方法相比，在稀释至 1:10 5 的肿瘤样本中发现了相当数量的突变，所需的测序量是原始方法的 1/50。结果表明，cfDNA 的检测限与传统 cfDNA 相当，
此外，与传统检测方法相比，使用cfDNA能够在肿瘤患者中检测到更多突变，并且在任何错配样本中均未检测到假突变，表明cfDNA可以准确检测全基因组肿瘤突变，提高MRD的检测效率。(图4c-d)
图 4.改进的术前 MRD 检测。
作为一种利用突变特异性短链探针结合二次捕获的测序方法，可通过高精度测序同时富集和检测数千种突变，在多种样本类型中具有很强的适应性dna突变，最多可追踪10,000种不同low- （提供强有力的方法，提高低频突变检测的广度、深度、准确度和效率。打破DNA测序广度和深度的束缚。使用更少的测序实现高精度检测，意味着在跟踪临床样本中的许多低频突变时，不再需要以广度换深度，或以准确性换效率。