【摘要】目的 研究鲍曼不动杆菌耐药性与耐药基因的关系。方法采用VITEK-2全自动微生物分析仪对331株鲍曼不动杆菌和42株多重耐药菌进行药敏检测，并采用PCR检测多重耐药菌的耐药基因。结果鲍曼不动杆菌对21种抗生素的平均耐药率分别为59.8%和62.8%；头孢曲松、头孢唑啉、头孢替坦耐药率均为100%；42株(100%)多重耐药菌株对头孢曲松、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、头孢唑啉、头孢替坦和氨苄西林完全耐药，均检测出TEM-1和ampC基因；38株多重耐药菌TEM-1、ampC、aac(3) 和 gyrA 基因都被检测到。结论 鲍曼不动杆菌已成为医院重要的致病菌，多重耐药率高，与携带的TEM-1、ampC、aac(3)、gyrA基因有关。

【关键词】鲍曼不动杆菌；多重耐药基因；耐药基因检测

-feng, XU-Lin, -hong.,,​​ 中国

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【】二;;

鲍曼不动杆菌已成为医院获得性肺炎的重要病原体，在重症监护室易传播。由于鲍曼不动杆菌在自然界中的广泛存在及其复杂的耐药机制，对β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素表现出多重耐药性，给临床治疗由其引起的感染带来了很大困难。. 为更好地指导临床选择合适的抗生素，本文对我院2005-2006年住院病人标本分离的331株鲍曼不动杆菌和2006年分离的42株多重耐药鲍曼不动杆菌进行了药敏分析。对不动杆菌基因进行了测序研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 本院临床标本分离鲍曼不动杆菌331株，按国家统一操作程序操作[1]。标本主要包括血液、尿液、痰液和其他分泌物。

1.2仪器试剂 VITEK-2全自动微生物分析仪、ID-GN鉴定卡、AST-GN09药敏卡均为法国Bio-生产；VITEK浊度计（V1210）日本产；PCR扩增仪采用美国公司Model 9600 gene ；日本三洋MDF超低温冰箱；德国公司22R低温超速离心机；美国水套式恒温培养箱。

1.3 菌种鉴定及药敏 所有实验菌株分离纯化后，按VITEK-2要求制备菌悬液和稀释液，分别填入ID-GN和AST-GN09卡，自动完成菌种鉴定通过VITEK-2仪器鉴定和药敏试验。

1.4 质控菌株为卫生部临床检验中心提供的大肠杆菌（ ）和铜绿假单胞菌（ ）标准菌株，药敏质控结果符合NCCLS药敏质控要求。

1.5 统计学分析[2]细菌耐药性分析采用软件进行分析，采用.0统计软件分析耐药率差异显着性，两组耐药率比较采用χ2检验。

1.6 耐药基因检测采用碱裂解法和蛋白酶K法提取供试菌的质粒和染色体基因。提取方法根据不同的引物设置不同的PCR条件；肺炎克雷伯菌和TEM-26大肠杆菌分别以SHV和TEM阳性对照作为阳性对照；其余ampC、PER-1、OXA-23基因阳性对照均为北京华明公司基因检测室基因测序后比对阳性菌株。

1.7 耐药菌的PCR基因[3] 根据提供的耐药基因，利用软件设计引物（见表1）。反应体系为25μl，包括2.5μl缓冲液、0.5μl/L4×dNTP、50μmol/1μl上下游引物、0.25μl DNA聚合酶、1μl DNA模板和18.75μl超纯水。根据不同的引物设置不同的PCR反应条件。肺炎克雷伯菌作为SHV型阳性对照，TEM-26型大肠杆菌作为TEM型阳性对照。电泳后，在紫外光下观察结果，并在凝胶上成像。表1 用于检测各种耐药基因的引物（略）

2 结果与分析

2.1 鲍曼不动杆菌临床分布 本文所有鲍曼不动杆菌均来源于我院住院患者，其中2006年采集160株，分为血（6株）、痰（136株）、尿（6株） ) )和其他分泌物12株；2005年171株，按标本分为尿液（5株）、痰液（82株）和其他分泌物（89株）。

2.2鲍曼不动杆菌对5大类21种常用抗生素的药敏结果见表2。2006年和2005年鲍曼不动杆菌对21种抗生素的平均耐药率分别为62.8%和59.8%。χ2检验差异无显着性(P>0.05)。2006年鲍曼不动杆菌对头孢曲松、头孢唑啉、头孢替坦的耐药率均为100%；对头孢他啶、头孢吡肟、头孢呋辛钠和头孢呋辛酯的耐药率分别为57.7%、44.6%、98.0%和98.0%。对β-内酰胺类和碳青霉烯类如氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐药率分别为100%、48.3%、54.4%、17.7%和75.8%，对亚胺培南的耐药率和美罗培南分别为 23.5% 和 38.3%，分别。2005年鲍曼不动杆菌对头孢曲松和头孢替坦的耐药率均为100%；头孢他啶、头孢吡肟、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、头孢唑啉的耐药率分别为43.9%、37.2%、92.1%、92.1%和96.5%。对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨水等β内酰胺类和碳青霉烯类抗生素的耐药率分别为100%、49.5%、55.2%、15.2%和86.9%，亚胺培南和美罗培南分别为 28.9% 和 34.9%。2006年和2005年鲍曼不动杆菌对呋喃妥因的耐药率为100%，对左氧氟沙星和环丙沙星的耐药率分别为8.4%、21.5%、75.4%和54.4%。

2.3 多重耐药菌药敏结果 2006年分离的42株多重耐药鲍曼不动杆菌对18种抗生素的药敏结果见表3。42株（100%）对头孢曲松、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、头孢唑啉、头孢替坦和氨苄青霉素完全耐药，35株（83%）菌株对氨曲南耐药；25株（60%）菌株对亚胺培南敏感，23株（55%）菌株对哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素和美罗培南敏感，17株（40%）菌株对庆大霉素和哌拉西林敏感。

2.4 耐药基因检测 42株多重耐药鲍曼不动杆菌中检测出TEM-1和ampC基因，5株（12%）检测出ESBLs，表明鲍曼不动杆菌对β-耐药内酰胺类抗生素具有高度耐药性；在38株（90%）多重耐药菌中检出TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA基因；1. 每个基因。所有菌株均未检测到SHV、PER-1、VEB-1、IMP、VIM、OXA-23、OXA-24型基因（图1）。表342 多重耐药鲍曼不动杆菌药敏结果（略）

2.5 测序结果对PCR型阳性扩增产物进行双向基因测序鲍曼不动杆菌，并与数据库中公布的相关基因序列进行比对分析。所有PCR产物与目的基因（）100%同源，产生广谱酶；4份OXA-23型PCR扩增阳性标本进行单向测序，与OXA-23碳青霉烯酶基因()序列同源性达99%；其余8个Ampc酶PCR阳性产物单向测序显示与染色体介导的高产Ampc酶靶基因( )同源性为100%；6个gyrA基因扩增产物与目的基因( )的测序对比显示，83位的丝氨酸均被亮氨酸取代。

3 讨论

3.1 本组鲍曼不动杆菌85%来自呼吸道标本，说明不动杆菌虽然是呼吸道的常驻菌鲍曼不动杆菌，但当它成为人体内的优势菌时，也会引起呼吸道感染，并可导致多器官、多系统感染，尤其是危重病人。大量广谱抗生素的应用使耐药鲍曼不动杆菌占优势，成为鲍曼不动杆菌肺部感染的危险因素。

3.2 本组鲍曼不动杆菌对5大类21种常用抗生素的平均耐药率分别为59.8%和62.8%，对头孢曲松、氨苄西林等5种头孢菌素的耐药率接近100%。对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为23.5%和38.3%，说明本组鲍曼不动杆菌存在严重的多重耐药。

3.3 本组鲍曼不动杆菌对氨苄西林/舒巴坦抑制剂​​的耐药率分别为48.3%和49.5%，均明显低于100%的氨苄西林耐药率。哌拉西林/他唑巴坦联合酶抑制剂的耐药率仅为17.7%和15.2%，表明舒巴坦和他唑巴坦均能有效抑制β-内酰胺酶。因为鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药主要产生β-内酰胺酶，而不动杆菌极易与质粒结合，并与多种耐药质粒共存。耐药性可能由质粒介导的 TEM-1 和 TEM-2β-内酰胺酶、染色体介导的 β-内酰胺酶或青霉素结合蛋白 (PBP) 的变化引起。所以，本组鲍曼不动杆菌对氨苄西林联合舒巴坦的耐药率由100%下降至48.3%，对哌拉西林联合他唑巴坦的耐药率由54.4%下降至17.7%。因此，在鲍曼不动杆菌感染的治疗中，可采用β-内酰胺类抗生素联合舒巴坦或他唑巴坦。不含酶抑制剂的抗生素不适合临床应用，不能作为经验用药。

3.4 鲍曼不动杆菌的耐药机制较为复杂，多重耐药率高。它还可以诱导革兰氏阴性杆菌产生ESBLs和高产AmpC酶的作用[4]。本组42株多重耐药鲍曼不动杆菌中检测出TEM-1和ampC基因，5株（12%）检测出ESBLs，说明鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗生素极为有效。耐药性高。特别是AmpC酶的普遍存在和过表达对β-内酰胺酶具有极高的水解活性，可水解第三代头孢菌素。由于AmpC酶是一种非诱导酶，因此无论诱导剂是否存在，水解酶都能以高水平产生。所以，

3.5 本组多重耐药鲍曼不动杆菌均产生氨基糖苷类乙酰转移酶[aac(3)-1和aac(3)-2]，而普通菌株不产生该酶，说明aac(3)基因是与鲍曼不动杆菌的多重耐药性密切相关。此外，gyrA和gyrB编码的两个A或B亚基分别是靶向喹诺酮类药物的DNA促旋酶，其主要功能是催化革兰氏阴性菌的DNA上层结构。耐药性取决于一个或两个DNA旋转酶基因的突变。在这组多重耐药菌株中，第83位的丝氨酸（TCA）被亮氨酸（TTA）取代就是对喹诺酮类药物的耐药性。原因。

3.6 本研究表明，鲍曼不动杆菌的多重耐药性与同时产生TEM型广谱酶、AmpC酶高产、aac(3)基因编码的氨基糖苷乙酰转移酶和aac(3)基因编码的DNA促旋酶突变密切相关。 gyrA基因。关系。

【参考】

…Wzyne, PA:, 1999, 32-36。

tion..WHO/CDS/CSR/DRS, 2001, 2.

3 张征，孙静娜，杨继章．检测产生去阻抑的持续高AmpC酶的鲍曼不动杆菌及耐药性分析。中国药学,2006,17(14):1091-1092.

4BouG,,-.OXA-24,-.other, 2000, 44(6):1556-1561。